The Kleiman lab
On the interface of Materials and Biology
אנו משתמשות בכלים סינתטיים על מנת להפריד בין ההשפעות הפיסיקליות לאלה הכימיות באינטראקציה בין הצמח לסביבתו.
פרוייקטי מחקר
1. ההשפעה של מיקרו מבנה פני שטח העלה על האינטראקציה עם מיקרו אורגניזמים
אנו משתמשות בליתוגרפיה על מנת להעתיק את מיקרו המבנה של פני שטח עלה עגבנייה כפי שמתואר בתרשים:
המשטח הסינתטי דמה למשטח העלה ברמת המיקרו מבנה, כפי שאפשר לראות בתמונה למטה.
תרשים: הכנת הרפליקה הסינתטית של העלה. את העלה מדביקים לצלחת פטרי. שופכים על גבי העלה את הפולימר הנוזלי. בשלב זה כדאי להפעיל ואקום על מנת להבטיח כיסוי טוב של המיקרו מבנה על ידי הפולימר. נותנים לפולימר להתקשות בטמפרטורה גבוהה יותר ואז מקלפים את העלה מהפולימר. עד שלב זה קיבלנו תמונת ראי של המיקרו מבנה של פני שטח העלה. משלב זה, נשתמש בתמונת הראי כתבנית לקבלת רפליקה למיקרו מבנה פני שטח העלה. יש לציין כי ניתן להשתמש באותה התבנית מספר רב של פעמים ובצורה זו לקבל העתקים מבניים רבים של אותו העלה בדיוק. משנים את הקבוצות הפונקציונליות על פני השטח של הפולימר על מנת להפכו להידרופילי ושופכים עליו פולימר נוזלי, מפעילים ואקום ונותנים לשכבה החדשה להתקשות. מקלפים את השכבה הישנה של הפולימר מהשכבה החדשה ומקבלים רפליקה סינטטית של מבנה העלה המקורי.
המשטח הסינתטי ישמש ללימוד השפעת טופוגרפית המשטח על האינטראקציה של הצמח עם סביבתו הכוללת: מיקרואורגניזמים, מקרואורגניזמים, אוויר ונוזלים.
לדוגמא, התפשטות ונביטת הפתוגן botrytis cinerea תלויה מאד במיקרו המבנה של פני השטח.
פרופורצית הנביטה של בוטריטיס על משטח PDMS עם וללא מבנה כפונקציה של הזמן
התפשטות של Botrytis cinerea על צלחת אגר עם וללא מבנה לאחר 3 ימים של אינקובציה
משטח אגר בעל מבנה
משטח אגר ללא מבנה
שטח העלה החלק יותר של קלה לבנה (שמאל) והמחוספס יותר של קלה צבעונית (ימין)
דוגמא נוספת היא יכולת החיידק הפתוגני Pectobacterium הגורם לריקבון רך בקלה - לייצר ביופילם על משטח סינתטי המחקה פני שטח עלה של קלה צבעונית, הרגישה לחיידק בעוד שאינו מייצר ביופילם על משטח סינתטי המחקה פני שטח של עלה מקלה לבנה העמידה יותר לחיידק.
פקטובקטריום מייצר ביופילם על רפליקה של קלה רגישה (למטה) אך לא על רפליקה של קלה עמידה (למעלה)
פקטובקטריום מייצר ביופילם על קלה רגישה (למטה) אך לא על קלה עמידה (למעלה)
תוצאות מהצילום התרמי: התמונות עצמן (למעלה), הגרף של הטמפרטורה כפונקציה של הזמן של טיפה מייצגת (אמצע) והנגזרת של הגרף אשר מראה את נקודת הייבוש - הנגזרת המקסימלית (למטה)
אנו משתמשות בצילום תרמי על מנת לעקוב אחר שינוי הטמפרטורה שמתרחש בזמן שטיפות מים מתייבשות על פני משטחים שונים לניתוח קינטיקת ההתייבשות. השוני בצורת ההתייבשות של מים על פני משטחים יכול להוות הסבר אופציונלי להבדלים שמצאנו בהתפזרות חיידקים על פני משטח.
תא שומר טמפרטורה בו אנו משתמשות לצילום תרמי של הטיפות המתייבשות
2. ההשפעה של מיקרו מבנה פני שטח השורש על האינטראקציה עם מיקרו אורגניזמים
באופן דומה לעלה, אנו מעוניינות בבנית שורש סינתטי, המחקה את מיקרו המבנה של פני השטח של השורש הטבעי. בניגוד לעלה, מיקרו המבנה של השורש נחקר פחות, ומעולם לא נבנה העתק סינתטי שלו.
פיתחנו במעבדתנו שיטה חדשה לחיקוי פני השטח של השורש על ידי שימוש בפוליאוריתן כרפליקה השלילית מכיוון שזהו פולימר נוזלי אשר מתקשה במהירות בחשיפה לאור אולטרה סגול. בשיטה זו הצלחנו לשכפל את שערות השורש.
הרפליקה הסינתטית של השורש עשויה מ PDMS ומראה חיקוי טוב של תאים בודדים והנצה של שערות שורש (תמונה תחתונה מימין) כמו גם שערות שורש מלאות (תמונה תחתונה משמאל).
על ידי שימוש בפוליאוריתן לרפליקה השלילית שלנו שיחזרנו את שערות השורש כפי שניתן לראות בחורים ברפליקה השלילית של הפוליאוריתן המסומנים בחיצים צהובים.
אנו מכוונות לרפליקה תלת מימדית של שורש יחיד ולאחר מכן של כל מערכת השורשים. השורש הסינתטי ישמש כמערכת מודל על מנת ללמוד את האינטראקציות עם האדמה ועם מיקרואורגניזמים מועילים ומזיקים. אנו מתעניינות באלמנטים מבניים המסייעים במעבר נוטריטנטים לדוגמא, כמו גם אלמנטים מבניים החיוניים לצורך עמידות לפתוגנים. אינטראקציה אחת שאנחנו בוחנות הינה האינטראקציה בין שורש עגבניה ונמטודת העפצים - נמטודה פרזיטית אשר תוקפת את הצמח דרך השורשים והורסת יבולים.
אנו חוקרות טווח רחב של חומרים על בסיס צלולוז אשר יחקו גם את מבנה פני השטח וגם את תכונות החומר של השורש. פיתחנו מערכת על בסיס קרבוקסימתיל צלולוז (CMC) אשר בעזרתה ניתן לבצע ויזואליזציה של פעילות אנזימתית של פירוק שרשראות צלולוז. ההילה בפילם ה CMC הצבוע מופיעה רק כאשר מוסף אנזים צלולאז אך לא בהוספת בופר, כפי שרואים ב A בתמונה מטה. מבחן בנדקיט הראה כי זוהי תוצאה של דגרדציה של ה CMC לחד או דו סוכרים, כפי שרואים ב B.
נמטודת העפצים חודרת לשורש עגבניה (מויקיפדיה)
מערכת ה CMC שבנינו, אשר יכולה לזהות פעילות צלולאז, מגיבה גם להפרשת אנזימים מפרקי דופן תא על ידי נמטודת העפצים, כפי שניתן לראות בהילות הקטנות אשר מופיעות בפילם ה CMC ומסומנות בחיצים כחולים. זה קורה גם בטמפרטורה של 37°C וגם ב 27°C. ניתן לראות את הנמטודות בבירור בהילות. התגובה מתגברת כאשר מוסיפים תמהיל שורש לפילם כפי שניתן לראות על ידי ההילה הגדולה שנוצרת עם תמהיל שורש. מיקם הנמטודות מסומן בחיצים ירוקים.
אנו מפתחות מערכת של פילמים העשויים מצורות שונות של צלולוז, המיצלולוז ופקטין אשר יחקו את הרכב דופן התא.
פיתחנו מבחן חדירה על מנת לבדוק את יכולת החדירה של נמטודת העפצים דרך פילמים שונים.
על ידי שימוש במבחן החדירה, מצאנו כי יכולות החדירה של נמטודת העפצים דרך פילם העשוי מ CMC או פילם משולב מ CMC, זילוגלוקן (צורה של המיצלולוז) ופקטין דומה לחדירתם דרך רשת בלבד. הנמטודות לא הצליחו לחדור דרך פילם PDMS אשר לא מכיל כלל פוליסכרידים אשר יכולים להגיב להפרשת של אנזימים מפרקי דופן תא.
על מנת לבחון את מנגנון החדירה, הדגרנו את הנמטודות בגלוקוז (מעכב של הפרשת אנזימים מפרקי דופן תא) לפני מבחן החדירה. מצאנו כי גלוקוז פוגע מעט בתנועת הנמטודות (בר אמצעי) אך משמעותית יותר, הפגיעה ביכולת החדירה (בר שמאלי). תמונות מיקרוסקופ אלקטרוני של הפילמים לאחר מבחן החדירה הראו הרס מוחלט של הפילם שנחשף לנמטודות הלא מעוכבות לעומת הרס חלקי של הפילם שנחשף לנמטודות מעוכבות, מה שמראה את החשיבות של הפרשת אנזימים מפרקי דופן תא לחדירת נמטודות.
3. ההשפעה של התכונות הפיסיקליות של הפלטפורמה על מעבר של קאלוס מפרוליפרציה לדיפרנציאציה
קאלוס הוא קבוצת תאים בלתי ממויינת. תאים אלה ידועים כתאים מתחלקים, יחד עם זאת, בהינתן הטריגר ההורמונלי המתאים, הם יכולים להפוך לתאים מתמיינים. אנו בודקות את ההיפותיזה שהתכונות הפיסיקליות של המצע עליו גדל הקאלוס יכול ות לשמש גם כן כטריגר למעבר זה. התוצאות הראשוניות שלנו מראות כי על מצעים פחות קומפרסביליים הקאלוס נוטה להיות יותר קומפקטי ולהראות יותר התמיינות.